单分子水平的动态结构生物学

许多蛋白质的结构已经使用 X 射线晶体学或冷冻电镜等方法成功解决。 然而，当这些技术遇到本质上无序的蛋白质或不结晶的蛋白质时，问题就显现出来了。 此外，观察蛋白质在其原生环境中执行任务时的动态构象变化需要不同的方法。

在这里，诸如 FRET 和 FCS 等单分子荧光方法开辟了新的可能性，因为它们能够在室温下研究溶液中、甚至细胞中的单个分子，并有可能区分不同位置的亚种群。

smFRET 可以监测附着在不同蛋白质残基上两个或多个荧光标记之间的距离变化，从而提供有关构象变化、折叠或蛋白质相互作用的宝贵信息。 这补充了蛋白质结构模型和分子动力学模拟，使研究人员能够更全面地了解蛋白质的功能。

纳秒时间尺度上的 FCS (nsFCS) 揭示了本质上无序或折叠蛋白质的蛋白质链的重新配置时间。 将这些信息与聚合物物理理论和分子模拟相结合，可以更清楚地了解无序蛋白质动力学。

FCS 在微秒到秒的时间尺度上测量分子扩散行为，和实验环境相关性非常高，可以很好的揭示蛋白质流动性、微环境，或蛋白质寡聚化和相互作用。

相分离驱动的细胞机制

液-液相分离正在成为调节细胞中生物分子空间组织的一种关键机制。 它的基础是通过分子子集的凝聚来进行区域化分隔，从而促进蛋白质相互作用。 由于相分离是一个非常动态的过程，它对环境条件的变化反应非常迅速。

荧光方法可用于研究相分离的动力学，跟踪分子进入不同相的分布，观察不同相的动力学，并探究它们的不同性质:

FCS 可以用于测量标记物种的浓度；它的扩展应用FCCS 和 FLCS 甚至可以同时测量多个物种的浓度。此外，FCS 检测了所研究分子的扩散速度，该扩散速度可能因相而异。

和局部环境粘度或刚度非常相关的分子旋转运动，可以通过荧光各向异性实验来进行观察，从而对FCS进行很好地补充。

被称为荧光传感器的FLIM，可以实时读取pH、温度、膜张力或各种离子浓度等环境参数。 这种额外的信息维度，可以帮助解释不同相的动态，并从物理角度理解它们的特性。

环境传感

蛋白质在细胞内的原生环境的特性，例如分子拥挤、pH 波动或质膜改变，都会影响其功能。 但在许多情况下，并非所有这些参数都是已知的，因此无法在实验中准确复现。

在过去的几年里，已经研发出一系列的荧光传感器，它们可以根据特定的环境变化，来改变它们的荧光寿命，例如温度、钙浓度、葡萄糖浓度或膜张力。通过 FLIM技术，可以以非侵入性方式从活细胞中实时定量读取这些参数，从而为更好地了解蛋白质功能或调节提供背景。

细胞膜动力学和结构的映射

细胞膜是高度复杂和动态的结构。 它们的脂质和膜蛋白的分子组成经过精确调整，从而可以获得其生理功能所必需的物理和化学特性。 可以结合互补的荧光方法从不同的角度对生物膜进行研究：

对带有荧光标记的脂质或膜蛋白进行FCS，可以得到其扩散速度和蛋白质迁移率。它还可以表征在研究分子的浓度，而这些浓度可能因地点而异。

通过各向异性实验，可以获得分子取向及其变化。因此，各向异性成像可以可视化有序和无序的膜相，或监测分子的旋转运动。

荧光寿命成像 (FLIM)

FLIM 是一种荧光寿命成像技术，可以解析和显示单个荧光团的寿命，而不是它们的发射光谱。 荧光寿命定义为分子在通过发射光子返回基态之前保持在激发态的平均时间。 由于荧光寿命与浓度、样品吸收、样品厚度、光漂白和激发强度无关，因此与基于强度的方法相比，FLIM 不易出现伪影。

FLIM 的优势：
. 可用于区分不同的荧光团
. 提供额外的信息维度
. 作为光谱信息的补充
. 成为多种功能成像的首选技术（因为荧光团的寿命会受到环境参数，例如 pH 值、离子或氧浓度或分子结合的影响）

FLIM-FRET – 基于寿命的 Förster 共振能量转移

FRET 是一种非辐射过程，其中来自激发的荧光分子（供体）的能量转移到附近2-10 nm 范围内的非激发荧光团（受体）。 能量转移导致供体猝灭、两个荧光团的荧光强度发生变化，以及供体寿命的缩短。

与测量荧光强度变化的标准 FRET 相比，基于寿命的 FRET 可以通过使用供体分子的荧光寿命作为探针进行定量分析，该荧光寿命与宽范围内的浓度无关。 这是至关重要的，因为在像细胞这样的生物系统中，荧光团浓度通常不能精确地测定，也不能在不同细胞之间进行比较。

FLIM-FRET的优势：基于寿命的FRET可以识别具有不同FRET效率的不同亚群，然而基于强度的FRET只能检测平均值。

smFRET – 单分子 Förster 共振能量转移

在这种类型的实验中，要么在单个分子（包含一个供体和受体）内观察到 FRET 过程，要么在自由扩散通过固定在表面上的共聚焦区域相互作用的分子之间观察到 FRET 过程。

一种对 smFRET 很有帮助的技术是脉冲交错激发 (PIE)，其中几个脉冲激光器是同步的。 激光脉冲在纳秒时间尺度上分离，从而允许同时记录样品分子的时间行为。

在 smFRET 实验中，可以用于交替激发供体和受体。 通过这种方式，受体染料独立于 FRET 过程被激发，以确认其存在和光活性。 缺乏活性供体或受体的分子与活性 FRET 复合体中分离出来。 这使得即使具有非常低 FRET 效率的 FRET 分子，也可以与具有不存在或不发荧光的受体的分子区分开来。

荧光相关光谱 (FCS)

荧光相关光谱 (FCS) 是一种利用荧光强度随时间波动进行相关性分析的荧光光谱技术。 它为引起这些特征波动的光物理学以及检测到粒子的扩散行为和绝对浓度提供了极具价值的参考信息。 FCS 能够测定重要的生化参数，例如颗粒（分子）的浓度、大小或形状或其环境的粘度。

荧光寿命相关光谱 (FLCS)

荧光寿命相关光谱 (FLCS) 是一种利用皮秒时间分辨荧光检测来分离不同 FCS 贡献的方法。
在荧光互相关光谱 (FCCS) 中使用寿命不同、光谱不可分离荧光团时，FLCS 具有特别的优势，因为它可以消除光谱串扰和背景噪声。 它还提供了一种解决探测器后脉冲伪影的方法。

荧光互相关光谱 (FCCS)

荧光互相关光谱 (FCCS) 是根据不同的发射光谱区分来自两种不同物种 FCS 信号的方法。

各向异性成像

稳态荧光各向异性、特别是时间分辨荧光各向异性的测量为研究分子取向和流动性以及影响它们的过程提供了极好的可能性。 一般来说，各向异性不依赖于荧光团的浓度，即与检测到的信号强度无关。这对于解释 smFRET 测量特别重要，其中荧光团迁移率可能会影响共振转移效率。 时间分辨各向异性测量提供更多信息，因为稳态测量仅为时间平均值，而没有直接洞察动态的过程。

使用 PAINT 和 dSTORM 为超分辨率 FLIM 修改的自定义模式

Luminosa 为方法开发提供了一种定制模式，其中每个光机组件都可以通过软件完全访问，并且可以自由选择参数。

利用这种模式超越了标准的 FLIM，展示了超分辨 FLIM。一方面，与弗里堡大学的 Guillermo P. Acuna 研究小组合作进行了 FLIM-PAINT 成像，另一方面，与哥廷根大学的 Jörg Enderlein 小组合作进行了 FLIM-dSTORM 成像。

单分子定位显微镜（SMLM）通过依次定位单个分子并随后合成超分辨图像，可提供空间分辨率超过衍射极限的图像。分子在亮态和暗态之间切换的机制各不相同，因此每帧图像只能定位一小部分分子。其中一种是纳米尺度地形图成像的 DNA 点积累（DNA-PAINT），它使用荧光标记的短寡核苷酸与互补的、目标结合的 DNA 分子瞬时结合。另一种方法是直接随机光学重构显微镜（dSTORM），在这种方法中，荧光团会闪烁，即随机开启、发射，然后迅速恢复到暗态。

在共聚焦成像中，扫描区域、像素数量和像素停留时间共同决定了每幅图像的采集时间。对于 PAINT，这需要与 DNA-PAINT 成像链的结合动力学相匹配，从而使采集时间大大小于平均结合时间。对于 dSTORM，则应根据荧光团的闪烁动力学来调整采集时间。

按照 SMLM 测量的通常做法，对由此产生的共焦 FLIM 图像系列进行分析，以获得最终的超分辨图像。最后，对每个单分子事件的光子到达时间进行检索和分析，以获得寿命对比度。

FLIM-SMLM 的优势:

• PAINT 或 dSTORM 带来的空间超分辨率
• 聚焦切片能力
• FLIM 带来的附加寿命对比，用于多路复用或 FRET
• 使用单激发激光的传统商用显微镜
• 可提供用于长时间测量的保持聚焦选项

InstaFLIM

• 快速分析，用户交互最少
• 4 种不同的分析程序并行运行：多指数衰减拟合、相量图、模式匹配和寿命直方图
• FLIM 物品种类分离的建议
• 建议的参数可以微调

InstaFCS

• 实时计算自相关和互相关曲线
• 在线 FCS 拟合，自动提供模型和参数建议
• 包括相关曲线的标准差

FRETcompass

• 效率与化学计量直方图的在线预览
• 自动测定单分子 FRET 实验中使用的校正因子
• 基于 2018 年发布的社区基准研究
• 所有通道中仅供体、低 FRET 和高 FRET 群体的荧光寿命衰减

LumiFinder

• 自动检测和测量固定式发射器
• 用于单分子研究，尤其是单分子 FRET 测量
• 根据可调节的选择标准，定位固定化发射器
• 在已识别的位置进行点测量，可定义测量时间
• 在线预览每个点采集的数据

大样品成像

• 螺旋扫描：在 DIC、外延照明或透射模式下创建概览，覆盖样品中几平方毫米的大面积区域。
• 参考图：对于选定区域或感兴趣点的进一步测量，并保存它们的空间关系以供分析
• 矩形区域的平铺和拼接
• 保持对焦功能

无样品自动对准

• 确保每次测量的最佳性能，即使是最具挑战性的测量
• 只需单击一下即可实现一致性

校准激发 (CalEx)

• 激发激光功率校准允许以 μW 为单位设置和显示激发强度
• 无需外部功率计

可变PSF (VarPSF)

• 在衍射极限和更大的观察体积之间切换
• 用于 FCS 和单分子 FRET 实验
• 使用自定义模式进行点变化 FCS 测量

NovaFLIM

• 基于 GPU 加速算法快速分析 FLIM、FLIM-FRET 和各向异性数据
• 对 z 堆栈、延时序列和拼接图像进行高效批量分析
• 先进、灵活的 ROI 处理
• 结合拟合参数直方图进行可重复的 ROI 选择

尖端硬件

• 基于倒置显微镜的共聚焦系统
• 激光波长为 375 至 1064 nm 的多功能激发系统
• 扫描选项：FLIMBee 振镜扫描仪和压电物镜扫描（成像速度或单分子研究的最高灵敏度）
• 多达 6 个真正并行的检测通道，带SPAD和/或混合 PMT
• 每个通道< 700 ps死区时间和5 ps的时间间隔

具有更高分辨率和更高对比度的功能成像

将图像扫描显微镜 (ISM) 的分辨率增强和对比度提高与 FLIM 的功能信息相结合。

无缝集成

专为 Luminosa 设计，确保完美的兼容性、优化的性能和强大的日常处理能力，包括简化的自动对准功能。

可定制的研究工具

利用开放式硬件和（.ptu） 数据格式，凭借 25 年的时间分辨光子检测经验，自信地为您的研究目标创建和调整新的时间分辨方法。探索 SPAD 阵列在成像、波动分析和单分子荧光模式方面能带来什么。

精度与兼容性的完美结合

PDA-23 探测器与MultiHarp 160 TCSPC 模块完美匹配.
PDA-23:

• 大有效填充因子
• 光子检测效率高
• 时间分辨率低于 100 ps
• 暗计数率低

• 多达 64 个独立输入通道
• 5 ps 时间分辨率
• 650 ps 的超短死区时间，跨通道无死区时间

体验ISM和FLIM的协同作用

将图像扫描显微镜（ISM）增强的空间分辨率和通过抑制焦外光而大幅提高的对比度与 FLIM 丰富的功能信息和多路复用可能性相结合。通过这种协同作用，可以更深入地探索细胞动力学和分子相互作用，提供传统共聚焦系统以前无法提供的细节。

真正实现所有通道的同步采集

Luminosa 的独特之处在于，PDA-23 探测器和其他点共聚焦探测器可以并行使用，以实现高分辨率和参考通道的多路复用。

ISM 的优势

• 每个阵列元件近似于零尺寸的共聚焦针孔
• 增加光学切片
• 像素重新分配后分辨率提高约 30%
• 对于 485 nm 激发：像素重新分配后分辨率低至 155 nm FWHM，去卷积后分辨率低至 120 nm FWHM
• 用于提高对比度的计算切片

用于ISM-FLIM的Luminosa软件功能

• 在线像素代码重新分配
• 自动确定偏移向量
• 在线寿命对比
• 用于标记物多重检测的 FLIM 分析