用于真正并行多目标成像的光谱分辨荧光寿命成像 (sFLIM)
• 结合寿命和光谱信息，明确识别多种不同的荧光标记
• 可将多种荧光标记与自发荧光进行有效的区分
• 支持高计数率工作，每秒可采集多张sFLIM图像
Spectral FLIM (sFLIM) 是一种结合光谱分辨和荧光寿命信息的成像方法。由于各种技术的提升，使sFLIM成为了一种快速、通用且灵敏的检测手段。其中一项重大的技术改进是使用 16 通道光谱荧光寿命成像探测器。该探测阵列中包含16个配备了GaAsP阴极的PMT检测器，其探测效率高达45%。sFLIM的探测器阵列连接到具有16个独立输入通道的TCSPC模块——MultiHarp 150。这些输入通道中的每一路都具有超低的死区时间——650ps，允许在TCSPC直方图失真最小和几乎没有光子计数损失的情况下，进行高计数率的sFLIM测量。
这种组合下的计数率高达65Mcps。由于荧光信号同时被记录在多个通道中，因此有效地降低了由探测器脉冲堆积效应导致的荧光衰减失真现象。因为MultiHarp 1502超短的死区时间，不会丢弃任何光子，将光子损失控制在最低限度。
另外，也已开发出一种模式匹配方法，通过充分利用光谱和寿命信息，以快速可靠的方式分析sFLIM的测量结果。通过使用多个散点图，可以一目了然地显示不同的光谱和寿命种群。通过在散点图中定义区域，可以推断出参考模式，然后将其用于sFLIM图像1的线性分解。这种模式匹配方法可作为公开访问的MatLab分析例程使用（托管在GitHub上）。请注意，该软件不是PicoQuant 的常规产品，因此PicoQuant不会为其提供任何技术支持。
sFLIM最具应用前景的方向就是同时测量多个荧光标记，如荧光蛋白，FRET探针或环境敏感探针。也可以区分由于样品自发荧光引起的荧光背景3。
用于真正并行多目标成像的光谱分辨荧光寿命成像 (sFLIM)
• 结合寿命和光谱信息，明确识别多种不同的荧光标记
• 可将多种荧光标记与自发荧光进行有效的区分
• 支持高计数率工作，每秒可采集多张sFLIM图像
间接标记技术对一抗和二抗对进行严格选择，以避免假阳性免疫标记。因此，间接免疫荧光通常局限于2~4种抗原，或者在最坏的情况下，目标分子标记的特定结合根本无法进行。
在此应用示例中，我们提出了一种新方法，通过光谱 FLIM-FRET 分离荧光信号来利用二抗交叉标记的表面缺点。这之所以成为可能，是因为二抗之间不希望的交叉标记导致产生新的特征 FRET 发射光谱，包括供体寿命的变化。为了证明这一点，我们采用了一种顺序标记方案，并在相互作用的二抗体(如Alexa488和Alexa546)上选择了合适的荧光团对，以实现强FRET现象。
作为模型，我们在人肺组织中标记了目标分子泛细胞角蛋白、TOM20 和高尔基体蛋白。一抗和二抗的结合导致了TOM20 的单标记以及泛细胞角蛋白的交叉标记。我们使用了一个八通道光谱分辨荧光寿命成像(sFLIM) 的检测系统，用两个激光波长在脉冲交替激发 (PIE)模式下，激发所有的标记，并获取了其数据。
通过采用源自未染色样品的三种模式来考虑来自人肺组织的强自发荧光（源自红细胞、胶原蛋白和残留的自发荧光 (AF)）。考虑到发射光谱以及纳秒时间分辨荧光衰减3，使用模式匹配算法1进行数据分析。
通过该方法，仅由两种荧光团产生的荧光，就使我们能够精确区分所有三种目标分子，这要归功于荧光团物质的交联和产生的FRET相互作用。同时，可以分离由人肺组织的三种自发荧光产生的外源荧光。因此，光谱FLIM-FRET与模式匹配分析一起通过克服二抗交叉标记的不良影响和区分不需要的组织自发荧光，形成了用于间接免疫荧光的出色工具。
1 Niehörster, T. et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, Nature Methods, 257-262, 13(3), 2016
2 Wahl, M. et al. Photon arrival time tagging with many channels, sub-nanosecond deadtime, very high throughput, and fiber optic remote synchronization, Review of Scientific Instruments, Vol.091, 013108. 2020
3 Rohilla. S. et al. Multi-target immunofuorescence by separation of antibody crosslabelling via spectral-FLIM-FRET, Scientific Reports, Vol.010, 3820, 2020
4 Meyer, J. et al. Rapid Fluorescence Lifetime Imaging Reveals That TRPV4 Channels Promote Dysregulation of Neuronal Na+ in Ischemia, Journal of Neuroscience, Vol. 42, Issue 4, 2022
